Palestrina reveló desde niño una relevante inclinación a la música, por lo que se le envió a Roma a estudiar música y gramática. Fue acogido entre los muchachos cantores de S. María la Mayor y en 1544 había conseguido ya una fama tan considerable, que fue designado maestro del coro y organista en la catedral de su ciudad natal. Su carrera es una de las más brillantes de toda la historia de la música.

Fue nombrado maestro de canto y director del coro infantil de la Capilla Julia de S. Pedro en 1551, bajo el pontificado de Julio II, al cual dedicó el I libro de Misas.

Cuatro años después consiguió entrar a cantar en el coro de la Capilla Sixtina (puesto ambicionadísimo). Desgraciadamente, su posición no fue bien vista por el papa Paulo IV, que licenció al músico por estar casado, lo cual era contrario a las normas de la Capilla Sixtina. Sin embargo, fue aceptado inmediatamente en la Capilla de S. Juan de Letrán y en 1560 pasó a la basílica de S. María la Mayor.

En 1580 perdió a su mujer, Lucrezia Gori, de la cual había tenido tres hijos, siendo tanto su dolor que pidió al Papa la concesión de las órdenes sagradas. Pero transcurridas apenas cinco semanas de haber sido nombrado clérigo beneficiado de Ferentine, olvidó de repente el luto y la vocación religiosa decidiendo casarse con una rica viuda romana, Virginia Dormuli. Murió en 1594. En sus funerales estuvieron presentes todos los músicos de Roma, en medio de un gentío enorme.

Características de su música. Después de los ingeniosos procedimientos polifónicos de casi dos siglos de escuela flamenca, P. venía a conciliar -como ha dicho justamente Karl Nef- «las finalidades de la palabra sagrada con las del arte musical, dando idéntica expresión a palabras y música».

En efecto, los flamencos habían cuidado tan amorosamente la música vocal, que la Iglesia había visto en su portentoso movimiento artístico la base granítica de elementos en verdad providenciales para la Liturgia. Y no dudó, por tanto, en llamar junto a sí a los flamencos, con el fin de que trabajaran para su más célebre capilla, al Sixtina.

Palestrina intentó componer una música que estuviera siempre o casi siempre al servicio de la religión católica. Juzgaba principalmente adecuado a su alto fin el uso de las voces humanas , excluyendo a priori cualquier instrumento. No quiso jamás someterse a la música instrumental.

Ennobleció, como ninguno antes y después de él, la voz humana. Su más famosa composición, aunque generalmente no se considere la más perfecta, es la Misa Papae Marcelli, importantísima por su conexión con la reforma de la música sagrada.